La respuesta es: gracias a una actividad enzimática que predice la viabilidad de las esporas.
Para que ocurra una reacción enzimática, se necesita dos actores fundamentales: una enzima y su sustrato (o un sustrato modificado compatible). En el sistema de fluorescencia Bionova®, la enzima se encuentra asociada a la cobertura de esporas (acumuladas durante la esporulación, en otras palabras, la formación de esporas) y el sustrato está incluido en el medio de cultivo sintético provisto en la ampolla de vidrio sellada del IB (ver Figura 1). Este sustrato corresponde a un carbohidrato no fluorescente que se convertirá en un subproducto fluorescente después de la actividad glucosidasa de la enzima asociada a las esporas (ver Figura 2). Dependiendo de la especie de bacteria incluida en el IB corresponderá una enzima: α-glucosidasa para Geobacillus stearothermophilus y β-glucosidasa para Bacillus atrophaeus. Vale la pena mencionar que nuestros IB no contienen OGM (Organismos Genéticamente Modificados) ya que las especies citadas anteriormente corresponden a especies bacterianas ATCC naturales. Además, no se agregan enzimas externas y el sistema se basa exclusivamente en las enzimas producidas naturalmente y asociadas a las esporas.
La reacción enzimática ocurre luego de la exposición del IB. Al quebrar la ampolla, enzima y sustrato entran en contacto (si persiste actividad enzimática luego del proceso de esterilización), ocurre la reacción enzimática en cuestión y se genera el subproducto fluorescente. La fluorescencia se detecta mediante un sistema de detección especial disponible en las auto-lectoras, diseñadas para este propósito.
En resumen (ver la Figura 3), el IB se expone al ciclo de esterilización. Después de retirarlo del esterilizador, se sella el tubo bajando la tapa y se quiebra la ampolla. Si el ciclo es subletal, algunas esporas sobrevivirán y por ende, también su actividad enzimática. Cuando las esporas sobrevivientes entren en contacto con el medio de cultivo, comenzarán a germinar y ocurrirá la reacción enzimática, lo que generará una señal de fluorescencia. Esta fluorescencia será detectada mediante sensores especiales dentro de los orificios de la incubadora/lectora automática, que informarán al usuario que el resultado es positivo, indicando una falla en uno o en una combinación de parámetros de esterilización.
Cuando el ciclo es letal, no quedarán esporas vivas y por lo tanto, tampoco habrá actividad enzimática. Esto significa que no se generará subproducto fluorescente; no se detectará fluorescencia en la incubadora/lectora, obteniéndose un resultado negativo. Esto se interpreta como un ciclo de esterilización exitoso en lo que respecta a la esterilidad.
Es muy importante que el usuario tenga en cuenta que este sistema predice los resultados con una alta sensibilidad. En este caso, los requerimientos de FDA (Food and Drug Administration, de sus siglas en inglés) establecen que esta predicción debe ser mayor al 97% y que el Tiempo de Incubación Reducido (RIT, de sus siglas en inglés Reduce Incubation Time) debe demostrarse con un informe RIT acorde (según el Anexo II de “Presentaciones de notificación de autorización del indicador biológico (BI) [510(k)] “de FDA).
Otra característica importante acerca de la predictibilidad del sistema de fluorescencia es su “Margen de Seguridad”, como se ilustra en la Figura 4. Este atributo de seguridad del sistema se basa en el hecho de que la actividad biológica de la enzima es más resistente que la inactivación de las esporas. De este modo, el sistema evita la posibilidad de obtener un resultado falso negativo (fluorescencia negativa pero crecimiento positivo), el cual puede implicar un riesgo muy alto para la esterilidad del proceso. Esto significa que cuando el ciclo de esterilización se encuentre en el margen de esterilidad, por ejemplo en una cámara sobrecargada, el sistema podrá distinguir y detectar esta situación, dando un resultado por fluorescencia positivo pero un crecimiento de esporas negativo (después de la incubación extendida). Este resultado debe considerarse como una falla en el proceso de esterilización y se deben tomar las medidas necesarias para corregirlo. En consecuencia, la actividad de las enzimas asociadas a esporas le otorga una mayor sensibilidad a un proceso de esterilización inadecuado o marginal en comparación con la resistencia propia de las esporas.
Como el usuario puede apreciar, el desarrollo de este tipo de sistema de predicción es definitivamente una oportunidad sin precedentes, que ha generado una carrera hacia el IB más rápido del mercado. Esto se traduce no solo a un reprocesamiento más rápido de los instrumentos y un monitoreo de esterilización más seguro, sino que también implicará una disminución en las inversiones del hospital en instrumental y dispositivos descartables. Por esta razón, el sistema de lectura por fluorescencia le ha dado a los IBs la oportunidad de resurgir luego de un largo tiempo de estar detrás de escena de los indicadores químicos, cuando los tiempos de lectura o la manipulación compleja dejaron a los IBs en las sombras.
